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    【產品編號】2793949

    【英文名稱】5fC fC-CET Kit

    【中文名稱】全基因組5-醛基胞嘧啶檢測試劑盒

    【產品內容】

    產品組成

    含量

    溶液P1Buffer P1

    2.4 mL

    AI溶液

    24

    DBCO20uM

    24ul

    Dynabeads™ MyOne™ Streptavidin C1

    480ul

    溶液BDBuffer BD

    480ul

    溶液BWBuffer BW

    10mL

    溶液TWBuffer TW

    5mL

    模式序列

    24ul

    5fC模式序列引物(10uM

    24ul

    Control模式序列引物(10uM

    24ul

    注:溶液P1:疊氮茚二酮反應液;AI:疊氮茚二酮

    【保存條件】AI溶液、DBCO、模式序列、5fC模式序列引物和Control模式序列引物置于

    -20 °C,可保存12個月。

    溶液P1、Dynabeads™ MyOne™ Streptavidin C1、溶液BD、溶液BW和溶液TW置于4 °C,可保存12個月。

    【產品概述】

    5-甲基胞嘧啶修飾(5mC)是真核細胞基因組中最為重要的表觀遺傳修飾之一。5mC可以在TET家族酶的作用下逐步氧化生成5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)、5-醛基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC);對于上述幾種新型DNA修飾的功能研究是目前核酸表觀遺傳學的一個研究熱點。

    百靈威推出新型5fC檢測試劑盒,它主要用于5-醛基胞嘧啶(5-formylcytosine, 5fC)的全基因組單堿基分辨率測序;也可應用于5fC在生物發育和疾病發生發展過程的生物學功能研究。

    【流程概述】

    5fC fC-CET Kit 原理圖

     【自備材料】

    •Oligo Clean & Concentrator (ZYMO, #D4060)

    NEBNext® Ultra™ II DNA Library Prep Kit for Illumina (NEB,#E7645)

    NEBNext Singleplex or Multiplex Oligos for Illumina (NEB #E7350, #E7335, #E7500, #E7600, #E6609, #E7710, or #E7730)

    NEBNext® End Repair Module (NEB E6050)

    AMPure XP Beads (Beckman Coulter, Inc. #A63881)

    SYBR Premix Ex TaqTM II (Takara, Cat. # RR82LR)

    MightyAmp® DNA Polymerase Ver.3 (TaKaRa, Cat.#R076A)

    Bio-Spin® P-30 Gel Columns, Tris Buffer (BioRad#7326231)

    二硫蘇糖醇DTT(0.05mM)

    無水乙醇

    滅菌超純水

    低吸附EP、PCR

    磁力架

    PCR熱循環儀

    旋轉混勻儀(Rotating Mixer)

    Thermo-mixer (Eppendorf)

    【注意事項】

    A.    磁珠操作注意事項:

    應將磁珠孵育至室溫后再使用

    每次吸取磁珠前都應將其充分混勻

    DNA樣品加入磁珠后應將其充分混勻

    所有磁珠操作都應于室溫進行

    移取上清操作應在磁珠被徹底吸附后小心進行

    磁珠在洗脫之前應充分干燥,避免乙醇殘留影響后續實驗

    B.    避免樣品交叉污染

    吸取不同樣品時更換槍頭

    C. 請嚴格按照實驗步驟進行,修改實驗步驟會對富集造成影響

    D. 酶的取放應在冰上進行,為避免反復凍融或長期使用后活性下降,我們推薦您在首次使用后將剩余試劑小份分裝凍存。

    【實驗步驟】

    . 末端修復

    1. 將片段化的DNA(平均長度約300bp),按照NEBNext® End Repair Module(NEB E6050)說明書進行末端修復。

    2. 按照AMPure XP Beads(Beckman Coulter, Inc. #A63881)說明書純化DNA。

    3. 加入52 ul 超純水,洗脫,吸取50 ul至新EP管中,準備下一步反應。

    注:純化后DNA純度要求:OD 260OD 280= 1.82.0

    . AI介導的5fC標記

    1. 向上述50 ul洗脫液中加入50 ul溶液P1,充分混勻。

    2. 全部轉移至裝有AI溶液的EP管中,充分混勻,置于Thermo-mixer (Eppendorf)中,37°C,850rmp反應24h。

    3. 24h后,將EP管取出,12,000 rpm (~13,400×g) 離心2 min。

    4. 將上清取出,轉移至新EP管中。

    注意:取上清時,若吸到沉淀,需重復步驟3。

    5. 按照Oligo Clean & Concentrator (ZYMO, #D4060) 說明書純化上清。

    . 文庫構建

    1. 按照NEBNext® Ultra™ II DNA Library Prep Kit for Illumina說明書,將上述純化后的上清進行NEBNext End Prep. Adaptor Ligation操作。

    2. 按照AMPure XP Beads(Beckman Coulter, Inc. #A63881)說明書純化上述產物,加入51 ul 超純水洗脫,吸取49 ul至新EP管中,準備下一步反應。

    四.化學反應

    1. 向上述49 ul洗脫液中加入1ul DBCO20mM),置于Thermo-mixer (Eppendorf)中,37°C,850rmp反應1h。

    2. 1h后,按照Oligo Clean & Concentrator (ZYMO, #D4060)說明書純化上述溶液。

    注:用25μl洗脫緩沖液洗脫。

    五.富集含有5fC的片段

    1. Dynabeads™ MyOne™ Streptavidin C1(以下簡稱C1 beads)處理:

    1)將Dynabeads™ MyOne™ Streptavidin C1(以下簡稱C1 beads)充分混勻, 吸取10ul至新EP管中。

    2)置于磁力架上,放置2.5 min,待溶液完全澄清后,棄去上清。

    3)加入1 mL溶液BW,將C1 beads完全重懸,置于旋轉混勻儀(Rotating Mixer) 旋轉混勻1 min。

    4)取下后短暫離心,置于磁力架上,放置2.5 min,待溶液完全澄清后,棄去上清。

    5)重復步驟3,4兩次。

    6)加入20ul溶液BD,重懸C1 beads待用。

    2. 20ul第四步純化后的DNA至新EP管中,加入20ul上述待用C1 beads,充分混勻,置于旋轉混勻儀(Rotating Mixer) 旋轉孵育30min。

    3. 取下后100g 離心10s,置于磁力架上,放置2.5 min,待溶液完全澄清后,棄去上清。

    4. 加入1 mL溶液BW,重懸C1 beads(注:動作盡可能輕揉),置于旋轉混勻儀(Rotating Mixer) 旋轉混勻3 min。

    5. 取下后100g 離心10s,置于磁力架上,放置2.5 min,待溶液完全澄清后,棄去上清。

    6. 重復步驟4,5三次。

    7. 加入1 mL溶液TW,重懸C1 beads(注:動作盡可能輕揉),置于旋轉混勻儀(Rotating Mixer) 旋轉混勻2min。

    8. 取下后100g 離心10s,置于磁力架上,放置2.5 min,待溶液完全澄清后,棄去上清。

    9. 重復步驟7,8一次。

    10. 加入10ul新配的0.05mM 二硫蘇糖醇DTT溶液,重懸C1 beads(注:動作盡可能輕揉),置于Thermo-mixer (Eppendorf)中,37°C,750rmp反應1h。

    注:0.05mM 二硫蘇糖醇DTT溶液需現配現用

    20min取出再混勻一次,防止C1 beads沉底

    11. 1h后,置于磁力架上,放置2min,待溶液完全澄清后,取上清至新EP管中,加20ul超純水稀釋。

    12. 按照Bio-Spin® P-30 Gel Columns說明書純化上述溶液。

    六.PCR富集

    1. 按照NEBNext® Ultra™ II DNA Library Prep Kit for Illumina (NEB,#E7645)說明書進行PCR 反應。

    2. 按照AMPure XP Beads(Beckman Coulter, Inc. #A63881)說明書純化上述PCR產物,加入23 ul 超純水,洗脫至新EP管中,于-20°C保存。

    【延伸拓展】

    5-羥甲基胞嘧啶作為基因組上另一種含量更高、更重要的核酸修飾,可以被氧化劑釕酸鉀特異性氧化成5-醛基胞嘧啶,而基因組上原有的5-醛基胞嘧啶可以被乙基羥胺特異性保護。將本試劑盒與5-羥甲基胞嘧啶的氧化和5-醛基胞嘧啶的保護結合起來,可以實現5-羥甲基胞嘧啶的全基因組單堿基分辨率檢測。釕酸鉀可通過購買高釕酸鉀(Aldrich, 334537)制備,乙基羥胺可直接購買(Aldrich, 274992)。具體操作可參照以下參考文獻:

    Hu Z. et al. Bisulfite-Free, Nanoscale Analysis of 5Hydroxymethylcytosine at Single Base Resolution J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 13


     

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