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    【產品編號】2749381

    【英文名稱】SPE-Ti-IMAC, 100%

    【中文名稱】固相萃取固定化親和色譜微球

    【產品內容】250mg, 2g

    【產品內容】室溫儲存,保存期為五年。
    【產品概述】本產品適用于對磷酸肽的鑒定和富集。

    【自備材料】

    樣品:蛋白酶解液

    注意:蛋白酶解液中不能含有干擾磷酸肽富集的物質,如EDTA等絡合劑、含磷酸根的緩沖鹽!

    Loading buffer80%ACN/6%TFA水溶液

    作用:將酶解液酸化,高濃度的TFA-可以抑制酸性肽段的殘留

    Wash buffer 1: 50%ACN/6%TFA/200 mM NaCl水溶液

    作用:洗滌非特異性吸附的肽段,鹽可以抑制非磷酸肽的殘留。

    Wash buffer 230%ACN/0.1%TFA水溶液

    作用:洗滌殘留的Wash buffer1中的鹽。

    Elution buffer10%氨水溶液

    耗材200 μL槍頭、600 ul離心管、1.5 ml離心管、直徑為1 mm的篩板

    Tip柱準備

    1)      1 mm的篩板填入200 μL槍頭中,如圖1a-b所示,盡可能填的靠近槍頭的底端。

     

    1

    2)      如圖2所示,將600 μL離心管剪開,在離心管蓋中間打孔,使200 μL槍頭可以卡在圖1c所示位置;

     

    2

    3)      如圖1d所示,1 mL離心管剪掉蓋子作為套管,然后在200 μL的槍頭中加入適量已螯合Ti4+SPE-Ti-IMAC材料,Tip柱制作完成,如圖3所示。

     

    3

    【注意事項】

    本產品SPE-Ti-IMAC材料未螯合Ti4+,首先應先將Ti4+螯合到材料上,然后再進行磷酸肽富集。

    200 ul槍頭一般建議最多裝10 mg SPE-Ti-IMAC材料,如果樣品起始量較大,請按比例增加SPE-Ti-IMAC材料使用量。當材料使用量為100 mg以下,可以使用柱管體積為1 mlSPE柱管及其對應篩板;當材料用量為100-200 mg時,可使用柱管體積為3 ml左右的SPE柱管及其對應篩板。

    【實驗步驟】

    一、  SPE-Ti-IMAC材料的Ti4+螯合

    1.      按照SPE-Ti-IMAC材料:硫酸鈦Ti(SO4)2 = 1:50 (m/m),稱取材料和硫酸鈦。以稱取500 mg材料為例,將25 g硫酸鈦固體加入50 mL平底離心管中,加入純凈水至40 ml,超聲溶解 (注意:硫酸鈦在溶解過程中會放熱,請緩慢加入)。向硫酸鈦溶液中加入SPE-Ti-IMAC材料,混勻,置于Rolling Incubator上搖勻,室溫過夜,請勿磁力攪拌。

    注意:可按照實際制備情況酌情稱取材料和硫酸鈦,建議SPE-Ti-IMAC材料不要低于500 mg。

    2.      次日,將步驟1中的SPE-Ti-IMAC材料靜置至其完全沉到離心管底部,棄上清。

    3.      加入適量0.1% TFA水溶液將SPE-Ti-IMAC材料分散,混勻,靜置至其完全沉到離心管底部,棄上清。

    4.      重復步驟3,洗5-6次左右,目的是盡量去除未螯合的Ti4+。

    5.      加入200 mM NaCl/0.1% TFA水溶液洗滌SPE-Ti-IMAC材料2次。

    6.      加入0.1% TFA水溶液洗滌2次,均勻轉移至離心管中,可根據實驗需求將SPE-Ti-IMAC材料分散成不同的濃度(如100 mg/ml10 mg/ml),于4℃保存。

    7.      檢測SPE-Ti-IMAC材料是否成功螯合Ti4+:取100 uL最后一次洗滌的上清液,加入100 uL 30% H2O2(市售雙氧水原液)中,若溶液不變色,說明螯合后的SPE-Ti-IMAC材料已經洗干凈。若溶液變色,則繼續洗滌。同時,可取少量SPE-Ti-IMAC材料,加入100 uL 30% H2O2中,若材料呈現明顯黃色,說明Ti4+螯合的SPE-Ti-IMAC材料制備成功,可用于后續磷酸肽富集。

    注意:上述3-6步驟為SPE-Ti-IMAC材料的洗滌,主要目的是洗滌未螯合的Ti4+,請勿省略。

    .     Tip (SPE)法富集磷酸化肽

    1.      蛋白酶解液與Loading buffer按體積比1:1均勻混合,SPE-Ti-IMAC:蛋白酶解液= 20:1-30:1m/m)均勻混合。以下以250 ug蛋白酶解液,SPE-Ti-IMAC材料:蛋白酶解液=20:1為例。

    注意:Loading buffer一定要足量,保證TFA終濃度≥3%;因SPE-Ti-IMAC材料在Ti4+螯合過程中會略有損失,建議根據實驗具體情況,自行優化材料與樣品的使用比例,以達到最優使用效果!

    2.      5 mgTi4+螯合的SPE-Ti-IMAC Tip柱中加入200 μL 0.1%TFA,清洗材料。

    3.      250 μL蛋白酶解液(1 μg/μL)與Loading buffer按體積比1:1充分混合,加入到Tip柱中進行富集,總時間控制在20 min左右。

    4.      加入200 μL Wash buffer 1洗滌,除去非特異性吸附,重復1次,總時間控制在10 min左右。

    5.      加入200 μL Wash buffer 2洗滌1次,除去上述步驟中殘留的鹽,時間控制在5 min左右。

    6.      加入200 μL Elution buffer洗脫2次,合并洗脫液,即富集好的磷酸肽,總時間控制在15 min左右。

    7.      洗脫的樣品在凍干機中凍干,于-20℃保存,質譜分析時需用1% FA復溶。

    注意:Tip法富集磷酸化肽一般通過離心的方式進行,一是為了更好的控制液體從Tip中的流出速度(以上述5 mgSPE-Ti-IMAC Tip柱為例,上樣和洗脫的過程離心力一般控制在80-100 g,洗滌過程控制在200 g),二是可以保證條件的一致,從而保證結果的重現性。上述2-5步驟中的時間為離心時間。

     

     

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