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    【產品編號】2749380

    【英文名稱】CAE-Ti-IMAC, 100%

    【中文名稱】單分散固定化親和色譜微球

    【產品內容】250mg, 1g

    【保存條件】室溫儲存,保質期為五年。

    【產品概述】本產品適用于對磷酸肽的鑒定和富集。

    【自備材料】

    •樣品:蛋白酶解液

    注意:蛋白酶解液中不能含有干擾磷酸肽富集的物質,如EDTA等絡合劑、含磷酸根的緩沖鹽!

    Loading buffer80%ACN/6%TFA水溶液

    作用:將酶解液酸化,高濃度的TFA-可以抑制酸性肽段的殘留

    Wash buffer 150%ACN/6%TFA/200 mM NaCl水溶液

    作用:洗滌非特異性吸附的肽段,鹽可以抑制非磷酸肽的殘留。

    Wash buffer 230%ACN/0.1%TFA水溶液

    作用:洗滌殘留的Wash buffer1中的鹽。

    Elution buffer10%氨水溶液

    【注意事項】

    本產品CAE-Ti-IMAC材料未螯合Ti4+,首先應先將Ti4+螯合到材料上,然后再進行磷酸肽富集。

    【實驗步驟】

    .    CAE-Ti-IMAC材料的Ti4+螯合

    1.      按照CAE-Ti-IMAC材料:硫酸鈦Ti(SO4)2 = 1:100 (m/m),稱取材料和硫酸鈦。以稱取300mg材料為例,將30g硫酸鈦固體加入250 mL燒瓶中,加入150 mL純凈水超聲溶解(注意:硫酸鈦在溶解過程中會放熱,請緩慢加入),超聲分散5-10 min,然后磁力攪拌(磁力攪拌的速度需要控制,將材料勻漿均勻為宜,不宜過快或過慢),室溫放置12h。

    注意: 可按照實際制備情況酌情稱取材料和硫酸鈦,建議CAE-Ti-IMAC材料不低于250mg。

    2.      將步驟1中的材料轉移至50 mL離心管中,15000 g離心3-5 min,棄上清。

    3.      加入適量0.1% TFA水溶液將CAE-Ti-IMAC材料分散,轉移至10 mL離心管中,振蕩洗滌未鍵合的Ti4+,15000 g離心3-5 min,棄上清。

    4.      重復步驟3,洗滌5-6次,目的是盡量去除未螯合的Ti4+。

    5.      加入200 mM NaCl/0.1% TFA水溶液,洗滌CAE-Ti-IMAC材料2次。

    6.      加入0.1% TFA水溶液,洗滌2次,均勻轉移至離心管中,可根據實驗需求將CAE-Ti-IMAC材料分散成不同的濃度(如100 mg/ml10 mg/ml),于4℃保存。

    7.      檢測CAE-Ti-IMAC材料是否成功螯合Ti4+:取100 uL最后一次洗滌的上清液,加入100 uL 30% H2O2(市售雙氧水原液)中,若溶液不變色,說明螯合后的CAE-Ti-IMAC材料已經洗干凈。若溶液變色,則繼續洗滌。同時,可取少量CAE-Ti-IMAC材料,加入100 uL 30% H2O2中,若材料呈現明顯黃色,說明Ti4+螯合的CAE-Ti-IMAC材料制備成功,可用于后續磷酸肽富集。

    注意:上述3-6步為CAE-Ti-IMAC材料的洗滌,主要目的是洗滌未螯合的Ti4+,請勿省略;因所用離心機不同,離心力可根據離心效果適當調整,保證離心后CAE-Ti-IMAC材料無懸浮,上清液澄清。

    .     溶液法富集磷酸化肽

    1.      蛋白酶解液與Loading buffer按體積比1:1均勻混合,已螯合Ti4+CAE-Ti-IMAC材料:蛋白酶解液= 20:1-30:1m/m)均勻混合,置于振蕩器上室溫振蕩30 min,然后15000 g離心3-5 min,棄上清。

    注意:Loading buffer用量一定要足夠,保證TFA終濃度≥3%;因CAE-Ti-IMAC材料在Ti4+螯合過程中會略有所損失,建議根據實驗具體情況,自行優化材料與樣品的使用比例,以達到最優使用效果!

    2.      加入適量Wash buffer 1,重懸材料,振蕩30min,15000 g離心3-5 min,棄上清。

    3.      加入適量Wash buffer 2,重懸材料,振蕩30min,15000 g離心3-5 min,棄上清。

    注意:步驟3可重復操作,目的是徹底清除NaCl,因為鈉鹽禁止進質譜!

    4.      加入適量的Elution buffer,冰浴超聲5 min,振蕩15 min,20000 g離心3-5 min,收集上清液(注意:盡量不要吸到沉淀的材料)。

    注意:建議重復步驟4,合并兩次洗脫液。

    5.      將合并洗脫液25000 g離心3-5 min,轉移上清至新離心管中。離心濃縮干燥后,-20℃保存,待質譜分析。

    注意:步驟5很重要,保證洗脫液中材料去除完全,以免后續分析時材料堵塞色譜柱!

    6.      將凍干后的樣品復溶在一定體積的1%FA水溶液中,質譜分析。

    注意:富集后的磷酸肽也可以用ZipTip StageTip進行除鹽后再質譜分析。

     

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